| |
Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов...
|
Абстракт
На крысах проведено сравнительное изучение влияния трансплантации эмбриональных фибробластов (ЭФ) и фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (ФМСК) на заживление глубоких ожоговых ран. Показано, что трансплантация ЭФ и ФМСК на поверхность раны уменьшает клеточную инфильтрацию раны, ускоряет новообразование сосудов и образование грануляционной ткани. Эти изменения создают условия для ускоренного заживления ожоговых ран по сравнению с контролем (без трансплантации клеток). Изучение особенностей процесса заживления ран при использовании ЭФ и ФМСК выявило более высокий темп регенерации под воздействием ФМСК.
There was made a comparative investigation of deep burn wounds in rats after transplantation of embrional fibroblasts (EF) and fibrablastoid Mesenchymal stem cells of marrow (FMSC). It was shown that the transplantation of EF and FMSC decreases cell infiltration, accelerates the formation vessels and granulation tissue. There processes accelerate the wound regeneration in experimental groups as compared with the control group (without cell transplantation). It was also shown that the regeneration rate in the group with FMSC transplantation was higher than in group with EF transplantation.
Ключевые слова: костный мозг, мезенхимальные стволовые клетки, фибробласты, ожог.
Введение
Современная медицина широко использует биотехнологические методы для лечения тяжелых повреждений различных органов.(3,13,14) Особое значение эти методы имеют при лечении обширных поверхностных и глубоких ожогов.
У ожоговых больных проводят коллагенопластику, трансплантацию криоконсервированной ксено-кожи, а также используют различные биополимерные покрытия (4,8,21).
Способы временного покрытия Ожеговых поверхностей ксенотрансплантатом, амниотической оболочкой, трупным аллотрансплантатом, синтетическими материалами недостаточно эффективны и не исключают использования аутодермопластики (Bell E. et al., 1983).
Между тем, из-за отсутствия активного биорегулирующего воздействия указанных методов на раневой процесс, а также сохраняющуюся опасность инфицирования ожоговых ран, поиск новых более эффективных биотехнологических методов продолжается. Были предложены методы клеточной терапии для лечения ожоговых ран: трансплантация ауто- и аллогенных кератиноцитов, трансплантация аллогенных фибробластов (1,2,6,10,11,12,16,18).
Использование аллогенных эмбриональных фибробластов (ЭФ) убедительно показало не только более быструю реконвалесценцию больных с различной степенью и площадью ожога, но и снижение их смертности (5).
Однако применение ЭФ столкнулось с возникновением этических, правовых и юридических проблем, а также выявило отсутствие законодательства, разрешающего забор и использование эмбрионального донорского материала. Указанные обстоятельства побудили нас к поиску новых источников получения донорского материала для трансплантации.
Получение и использование фибробластов из кожи человека было отвергнуто нами из-за необходимости использования дорогостоящих сред для их культивирования и наращивания клеточной массы, а также из-за быстрого перехода фибробластов в фиброциты, которые обладают менее выраженными ростстимулирующими свойствами (7).
В связи с вышеизложенным, наше внимание привлек костный мозг, как источник получения не только стволовых клеток гемопоэтического ряда, но и мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Было показано что, МСК костного мозга обладают уникальной способностью практически бесконечно пролиферировать и при создании оптимальных культуральных условий дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения, а именно: фибробластоподобные, адипоцитоподобные, миоцитоподобные, остеобластоподобные и хондроцитоподобные клетки(15,17,19,20) Возможность получения фибробластоподобных клеток из МСК костного мозга с образованием монослоя этих клеток в культуре побудила нас провести сравнительные исследования эффективности лечения глубоких ожоговых ран аллогенными ЭФ и аллогенными МСК для обоснования возможности и целесообразности использования аллогенных и аутогенных МСК в клинике.
Материалы и методы
а
Глубокий термический ожог кожи моделировали на 30 крысах самцах линии Вистар массой 300-350 г. Под эфирным наркозом ожог у животных вызывали прикладыванием металлической пластинки к коже, через которую циркулировала вода, нагретая до 97,70 С. Время экспозиции пластины через влажную салфетку составило 8 сек. Площадь пластины составляла 18- 20% общей поверхности кожи крысы. При указанных режимах экспозиции достигалось повреждение всех слоев кожи. Животные были разделены на 3 группы: 1) крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных ЭФ (10 крыс), 2) крысы с глубоким термическим ожогом и трансплантацией аллогенных МСК (10 крыс), 3) крысы с глубоким термическим ожогом без применения клеточной терапии (10 крыс, контрольная группа).
Суспензию ЭФ и фибробластоподобных мезенхимальных стволовых клеток (ФМСК) наносили на поверхность ожоговой раны с помощью пипетки в количестве 2 х106 клеток на вторые сутки после моделирования ожога и иссечения образовавшегося некротического струпа. После трансплантации клеток, ожоговую поверхность покрывали марлевой салфеткой, смоченной физиологическим раствором с гентамицином. Контроль эффективности клеточной терапии осуществляли визуально, планиметрическим и морфологическим методами.
ЭФ получали из легких 14-17 дневных эмбрионов крыс, путем механического измельчения ткани легких. Полученные кусочки ткани трипсинизировали в инкубаторе в течение 10-15 мин, после чего эти кусочки ресуспендировали пипетированием. Суспензию клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, супернатант полностью удаляли отсасыванием. Осадок ЭФ ресуспендировали в ростовой среде DMEM с эмбриональной телячьей сывороткой.
Забор клеток костного мозга проводили у взрослых крыс породы Вистар под эфирным наркозом. Клетки получали из бедренных костей с промыванием полости кости забуференным физиологическим раствором с использованием иглы 16G. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе в течение З мин и вновь центрифугировали. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок МСК ресуспендировали в ростовой среде IMDM (Gibco, Grand Island) с эмбриональной телячьей сывороткой и добавками.
Клетки ЭФ и МСК предварительно культивировали на чашках Петри d=90 мм при 37°С в С02- инкубаторе, в атмосфере с 5% С02 и с 95% влажностью. ЭФ культивировали в течение 4- 6 суток. Для получения монослоя МСКтребовалось 14-17 суток. Образцы культур трансплантируемых ЭФ и ФМСК представлены на рис 1 (А и Б). Получение достаточной массы МСК в культуре сопровождалось удалением клеток гемопоэтического и тромбоцитарного ряда. В дальнейшем МСК сохраняли методом криоконсервации как исходный материал для получения ФМСК. Для получения ФМСК проводили пассаж МСК. Монослой ФМСК из МСК образовывался в течение 4 суток, причем количество клеток ФМСК более чем в 3 раза превосходило количество клеток ЭФ, образующихся в течение того срока культивирования.
Визуальный, планиметрический и гистологический контроль осуществляли на 1,3,7,10,15 и 30 сутки после трансплантации клеток на ожоговую поверхность.
Для морфологического исследования брали биоптаты кожи в указанные сроки и готовили криостатные срезы толщиной 7мк, которые окрашивали гематоксилин-эозином.
Статистическую обработку результатов планиметрии проводили, используя критерий достоверности t- Стьюдента.
Полученные результаты и обсуждения
В результате динамического визуального, планиметрического и гистологического контроля состояния ожоговой раны было установлено, что уже на 3 сутки после трансплантации клеток в выделенных группах наступала отчетливая разница в течении раневого процесса. Так, после трансплантации ЭФ (I группа) на поверхности раны появлялись сосудистые звездочки розоватой окраски, которые представляли собой скопление новообразованных сосудов. Одновременно на поверхности раны возникали островки тонкой коллагеновой пленки, за счет которой снижалась плазморрея. Продуцентами этой пленки, очевидно, являлись ЭФ. Гистологически на 3-е сутки после трансплантации ЭФ выявлялись признаки уменьшения клеточной инфильтрации раны по сравнению с контролем.
В отличие от использования ЭФ при трансплантации ФМСК (II группа) на 3-и сутки поверхность раны была более розовой за счет выраженного развития сосудистой сети; ожоговая поверхность покрывалась более отчетливо выраженной коллагеновой пленкой, исчезала плазморрея. Гистологически на 3-и сутки после трансплантации выявлялось уменьшение клеточной инфильтрации ткани, при этом появлялись в значительно большем количестве по сравнению с трансплантацией ЭФ участки с новообразованной сосудистой сетью.
В контрольной группе животных (III группа), в которой не проводилась клеточная терапия, ожоговая поверхность мало чем отличалась от исходного состояния раны: рана оставалась бледной, рыхлой и отечной. На гистологических срезах отмечалась густая инфильтрирация лимфо-лейкоцитарными клетками, при этом полностью отсутствовали новообразованные сосуды. Более того, существующие сосуды были тромбированы.
На 7-е сутки у животных I группы грануляционная ткань местами приподнималась до уровня эпидермиса краев раны, в то же время плазморрея из раны несколько возрастала, а коллагеновая пленка практически исчезала. Эти изменения расценивались нами, как указание на снижение функциональной активности ЭФ в ране, о котором сообщалось ранее (9).
В отличие от I группы, у животных II группы, которым были трансплантированы аллогенные ФМСК, рана приобретала равномерно розовую интенсивную окраску, грануляционная ткань разрасталась на всей площади раны до уровня эпидермиса, а ожоговая поверхность значительно сокращалась в размерах. Несколько истончалась коллагеновая пленка на поверхности раны, но продолжала покрывать всю ожоговую площадь.
При гистологическом исследовании тканей ожоговых поверхностей у животных I и II группы (рис 2) на 7 сутки отмечалось снижение клеточной инфильтрации и развитие сосудистой сети, причем эти признаки начинающегося регенераторного процесса были более выражены во II группе животных.
В контрольной группе, без проведения клеточной терапии, ожоговая рана представляла собой бледную, изрытую, неживую ткань, покрытую фибрином, имела место плазморрея по всей ожоговой поверхности. При гистологическом исследовании криостатных срезов ожоговой поверхности (рис 2) сохранялись признаки клеточной инфильтрации без появления гистологического рисунка новообразованных сосудов.
На 15 сутки различия в заживлении ран между I, II и III группами животных становились еще более отчетливыми (рис 3). Так в I группе животных площадь ожоговой поверхности сокращалась за счет краевой эпителизации по сравнению с ранами у животных III группы (контроль). Во II группе гранулирующая поверхность была более сочной и гладкой, а площадь ожоговой поверхности была значительно меньше, чем в остальных группах животных. На криосрезах грануляционной ткани в этой группе животных отмечалось существенное увеличение количества сосудов. В то же время в контрольной группе животных, ожоговая поверхность местами оставалась бледной с редкими грануляциями, на ней появлялись сосудистые звездочки, имелись островки фибринозного налета, продолжалась умеренная плазморрея по всей ожоговой поверхности, местами сохранялся трудно отделяемый струп. В целом у животных III группы уменьшались размеры раны, но края раны оставались подрытыми.
Таким образом, при сравнительном исследовании темпов заживления ран при отсутствии клеточной терапии и использовании ЭФ и ФМСК нами отмечен более высокий темп заживления ожоговой поверхности при трансплантации ЭФ и ФМСК. В то же время при использовании аллогенных ФМСК темп заживления ран был выше, чем при трансплантации ЭФ. Это выражалось в ускорении смены фаз регенераторного процесса: сокращались сроки периода клеточной инфильтрации и ускорялся темп разрастания сосудистой сети и образования грануляционной ткани. Регенераторный процесс в ожоговых ранах без клеточной терапии также имеет место, но темп его был резко замедлен. Доказательством более высокого темпа заживления ожоговой поверхности при проведении клеточной терапии могут служить результаты динамической планиметрии ран в трех группах наблюдений (рис 4). Из этого рисунка видно, что темп спонтанного заживления ожоговой раны без использования клеточной терапии остается достоверно более низким. После трансплантации аллогенных ЭФ и ФМСК темп заживления ран достоверно увеличивается на 7 сутки по сравнению с контролем (р< 0,05), однако на 15 сутки при трансплантации ЭФ темп заживления ран достоверно отстает от темпов заживления ран при трансплантации аллогенных ФМСК (р< 0,05).
Выводы:
1. ЭФ и аллогенные ФМСК ускоряют темп заживления глубоких ожоговых ран.
2. Ускорение процесса заживления ран под влиянием трансплантированных клеток происходит за счет уменьшения выраженности воспалительной инфильтрации раны, а так же существенного ускорения темпов разрастания сосудистой сети и формирования грануляционной ткани.
3. При выборе клеточного материала предпочтение следует отдавать ФМСК, так как использование ФМСК характеризуется более высоким темпом регенерации ожоговых ран, а на этапе подготовки клеточного материала к трансплантации (т.е. при направленном культивировании МСК) отмечается более высокий темп накопления клеточной массы для последующего применения.
В.И. Шумаков, М.Ф. Расулов, М.Е.Крашенинников, В.А. Зайденов, Н.А.Онищенко.
НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, г Москва.
Литература:
Жилина Н. М., Иванов В. Б., Корень Н. Н., и др./ Сравнительный анализ кожной аутопластики традиционными методами и с использованием клеточной культуры фибробластов./ Вестник новых медицинских технологий - 1997 -Т. IV, №1 С. 88.
Малахов С.Ф., Парамонов Б.А., Емельянов А.В., и др./ Новые подходы к лечению тяжелых ожогов: трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов. / Военно-медицинский журнал 1997. Т 318. N 9. С.16-19.
Онищенко Н.А., Базиева Ф.Х., Иванова- Смоленская И.А. и др. / Экстракорпоральное подключение систем биоискусственной поддержки печени в комплексном лечении гепатоцеребральной дистрофии./ Вестник трансплантологии и искусственных органов. 1999, №1, С. 54-59.
Путилин А.А., Самсонов А.В., Денисов И.А. /Сравнительная оценка эффективности применения биологически активных покрытий, созданных на основе ксено- и аллотканей в местном лечении глубоких ожогов. В сб. "Комбустиология на рубеже веков" Мат. Конгресса. Москва, 2000, с. 128.
Саидгалин Г.З., Салистый П.В.,.Панова О.В, и др. /Аллофибробласты в лечении глубоких ожогов у детей. В сб. "Комбустиология на рубеже веков" Мат. Конгресса. Москва, 2000, С. 120.
Саркисов Д. С., Алексеев А. А., Глущенко Е. В., Морозов С. С., Серов Г. Г., Туманов В. П., Федоров В. Д./Теоретические и практические аспекты использования культивированных фибробластов при восстановлении целостности кожных покровов. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996. №6,. С. 6-11.
Серов В. В., Шехтер А. Б./ Соединительная ткань: Функциональная морфология и общая патология).— М. 1981, С. 8-34.
Сологуб В.К., Донецкий Д. А., Борисов В.Я., Яковлев Г.Б., Лагвилава М.Г.,/ Клиническое применение консервированных биопокрытий для ран и ожогов. Москва, 1990, С. 8.
Туманов В. П. /Способ получения трансплантата из культивированных фибробластов человека для лечения обожженных./ Межд.симп."Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных клеток кожи" г.Тула 1996 стр.11
Туманов В. П., Глущенко Е. В., Морозов С. С., Саркисов Д. С./ Использование культивированных фибробластов при лечении ожоговых ран. Бюлл. экспер. Биол. и мед. 1990. №4, С. 400—402.
Туманов В. П./ Морфологический анализ клеточного состава ожоговой раны при трансплантации культивированных аллофибробластов./ в кн.: Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных аллофибробластов. Международный симпозиум. Саратов, 1998, С. 40.
Федоров В.Д. , Саркисов Д. С., Алексеев А. А,, В. П, Туманов, Серов Г. Г. / Пластическое восстановление кожных покровов с использованием культивированных фибробластов./ Анналы Хирургии 1996. №4, С. 16-19.
Цыпин А.Б., Макаров А.А., Сафаров С.Ю., и др./ Терапия септических состояний с помощью подключения ксеноселезенки./ Тез. докл. 7-го Международного симпозиума по гемосорбции. - Киев, 1986. С. 124-125.
Шумаков В.И., Писаревский А.А., Онищенко Н.А. и др./ в кн. Очерки по физиологическим проблемам трансплантологии и применения искусственных органов» Тула, «Репроникс Лтд.» 1998, С. 338-376.
Gruber R, Mayer C, Schulz W, Graninger W, Peterlik M, Watzek G, Luyten FP, Erlacher L.// Stimulatory effects of cartilage-derived morphogenetic proteins 1 and 2 on osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells. // Cytokine 2000, V12, N11, P. 1630-1638.
Hansbrough J.F. Boyce S.T. et al Burn wound closure with CAE & fibroblasts attached on to a collagen-glycosaminoglycan substrate / JAMA 1989. Vol.262 N15 P.2125-2130.
Majumdar MK, Banks V, Peluso DP, Morris EA.//Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells.// J Cell Physiol 2000, V185, N1, P. 98-106.
O'Connor N. E., Mulliken J. B., Banks-Schlegel S., Kehinde 0.. Green H./ Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells./ Lancet.- 1981, №1-P. 75-78.
Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et. al.// Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells // Science 1999, V.284, 2 april, P. 143-147.
Seshi. B, Kumar.S. Sellers.D.// Human Bone Marrow Stromal Cell: Coexpression of Markers Specific for Multiple Mesenchymal Cell Lineages //Blood Cells, Molecules, and Diseases 2000, V.26, N.3, June, P. 234–246.
Smith DJ Jr./ Use of Biobrane in wound management./ J Burn Care Rehabil 1995; 16.(3Pt 1) 317-320.
|
|
| |
 |
Разделы
статей : : |
|
|
| |
|
Статьи раздела : : |
|
|
|
|
|
